小鼠心肌成纤维细胞分离模型

检测概述

2022-11-30 17:26:20     TAG:

  小鼠心肌成纤维细胞分离模型

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  动物品系:大 小鼠

  实验分组:正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组低、中、高三个剂量组

  实验周期:N

  建模方法:

  1. 小鼠颈椎脱臼处死后,剃除腹胸部的被毛,放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。

  2. 取出小鼠,在无菌环境下打开胸腔,取出心脏组织,注入盛有无菌1×PBS的培养皿中,洗净组织表面的血液。

  3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞,浸泡完成后立即转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。

  4. 清洗完成后,用剪刀镊子配合除去主动脉弓和心房组织,仅保留心室部分,再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。

  5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块,之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。

  A. 贴块法

  6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中,用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织,室温消化3-5 min。

  7. 消化完成后,添加数毫升FBS终止消化,之后吸弃液体,加PBS清洗组织块1伺次后,用200 ul吸头将组织块平均接种于T-25培养瓶的培养面上,之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中,静置2-4h。

  8. 待组织处于略微脱水的状态时,小心添加2ml完全培养基,添加时注意尽量不要将组织块冲起,要使培养基接触所有的组织块。

  9. 之后放入培养箱中继续培养,一般2-4天后成纤维细胞会从组织块周围爬出,待爬出的细胞有较多数量时,可将细胞消化下来,去除组织块,转入另一培养瓶中培养。

  B. 消化法

  6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中,加入混合消化液(0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶)37℃水浴消化8 min后,吸取上层混悬液弃去。

  7. 余下组织加入混合消化液10 ml,37℃水浴震荡消化10 min;吸取上层悬液至另一离心管中,加入适量FBS终止反应;剩余沉淀物再加消化液消化3-5次,直至组织块完全消化。

  8. 按1∶1加入含血清的培养基,中止酶反应,悬液过200目网筛去除较大的组织块。

  9. 收集全部中止后的消化液于离心管中,300g,离心10 min,弃去上清,加入培养液重悬细胞后计活细胞数。

  10. 调整细胞密度以1× 106个/ml 接种入的T-25培养瓶中,每瓶添加2 ml细胞悬液。

  11. 培养瓶放置于37℃,5% 二氧化碳培养箱中静置40min后,吸弃上清液以去除未贴壁的非成纤维细胞和死细胞,再添加5 ml完全培养基继续培养。

  三 传代步骤

  如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

  1. 弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

  2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

  3. 按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

  4. 将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

  四 复苏步骤

  将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。

  五 冻存步骤

  待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面T25瓶为例:

  1. 细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入2ml完全培养基终止消化,可使用血球计数板计数。

  2. 1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮,加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀,按每1ml的数量分配到冻存管中,注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X10^6个细胞冻存。

  3. 将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

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