免疫组化

免疫组化技术是现代生物医学研究与临床病理诊断中的关键工具，其核心是利用抗原-抗体特异性结合反应，通过标记抗体对组织或细胞中的特定抗原（蛋白质、多肽等）进行定位、定性与相对定量分析。该技术融合了免疫学、组织化学与分子生物学原理，具有高度特异性与灵敏性。

一、检测项目

1. 细胞角蛋白（Cytokeratin， CK）

   • 原理：针对上皮细胞骨架中间丝蛋白家族。不同类型的CK（如CK7、CK20、CK5/6、CK19）在各类上皮及其肿瘤中表达谱系不同。

   • 方法：采用广谱CK（AE1/AE3）或特异性单克隆抗体进行标记。

   • 意义：鉴别癌与肉瘤（癌阳性）、确定上皮来源肿瘤的分化方向与转移灶原发部位。

2. 波形蛋白（Vimentin）

   • 原理：针对间叶细胞骨架中间丝蛋白。

   • 方法：单克隆抗体标记。

   • 意义：间叶源性肿瘤的标志物（如肉瘤、淋巴瘤），常与CK联用以鉴别癌与肉瘤；亦可在某些上皮源性肿瘤发生上皮-间质转化时表达。

3. 白细胞共同抗原（Leukocyte Common Antigen， CD45）

   • 原理：针对造血细胞表面的跨膜酪氨酸磷酸酶受体。

   • 方法：单克隆抗体（如2B11+PD7/26）标记。

   • 意义：淋巴造血细胞的特异性标志，用于鉴别淋巴瘤/白血病与非造血系统小圆细胞肿瘤。

4. Ki-67

   • 原理：针对存在于增殖期细胞（G1、S、G2、M期）核内的非组蛋白，静止期（G0期）细胞不表达。

   • 方法：MIB-1等单克隆抗体标记，计算阳性细胞百分比（增殖指数）。

   • 意义：评估细胞增殖活性，是肿瘤分级、预后判断及治疗反应预测的重要指标。

5. 雌激素受体（Estrogen Receptor， ER）与孕激素受体（Progesterone Receptor， PR）

   • 原理：针对细胞核内的类固醇激素受体蛋白。

   • 方法：单克隆抗体（如ER：SP1；PR：1E2）进行核染色。

   • 意义：乳腺癌等激素依赖性肿瘤的必检项目，阳性提示内分泌治疗有效且预后较好。

6. 人表皮生长因子受体2（HER2/neu）

   • 原理：针对细胞膜上的跨膜酪氨酸激酶受体蛋白。

   • 方法：采用单克隆抗体（如4B5）进行膜染色，依据染色强度与完整膜阳性细胞百分比进行评分（0， 1+， 2+， 3+）。

   • 意义：乳腺癌和胃癌的重要预后与预测指标。3+为阳性，提示可从抗HER2靶向治疗中获益；2+需行荧光原位杂交（FISH）进一步验证。

7. 突触素（Synaptophysin， Syn）与嗜铬粒蛋白A（Chromogranin A， CgA）

   • 原理：Syn针对神经元突触前囊泡膜蛋白，CgA针对神经内分泌细胞胞浆内颗粒蛋白。

   • 方法：特异性单克隆抗体分别标记。

   • 意义：神经内分泌肿瘤的特异性标志物，用于诊断类癌、副神经节瘤、神经内分泌癌等。

8. 甲状腺转录因子-1（Thyroid Transcription Factor-1， TTF-1）

   • 原理：针对甲状腺、肺泡Ⅱ型上皮及部分呼吸道上皮细胞核内表达的核蛋白。

   • 方法：单克隆抗体（如8G7G3/1）核染色。

   • 意义：肺腺癌（阳性）与肺鳞癌（通常阴性）的鉴别标志；亦用于甲状腺原发肿瘤的判定。

9. CD3， CD20， CD79a

   • 原理：CD3为T淋巴细胞表面复合物，CD20与CD79a为B淋巴细胞特异性标志。

   • 方法：特异性单克隆抗体分别标记。

   • 意义：用于淋巴瘤的免疫表型分型，鉴别T细胞与B细胞来源，是淋巴造血系统肿瘤诊断的核心指标。

10. 错配修复蛋白（MLH1， MSH2， MSH6， PMS2）

    • 原理：针对DNA错配修复系统的核心蛋白，其缺失导致微卫星不稳定性（MSI）。

    • 方法：单克隆抗体分别进行核染色，判读为蛋白表达缺失（阴性）或保留（阳性）。

    • 意义：筛查林奇综合征（遗传性非息肉病性结直肠癌）及预测结直肠癌、子宫内膜癌等对免疫检查点抑制剂治疗的反应性。

11. PD-L1（程序性死亡配体1）

    • 原理：针对肿瘤细胞或免疫细胞表面表达的免疫检查点蛋白。

    • 方法：多种伴随诊断抗体（如22C3， SP142， SP263）进行膜/胞质染色，采用特定的评分标准（如肿瘤细胞阳性比例评分TPS，联合阳性评分CPS）。

    • 意义：预测非小细胞肺癌、胃癌、尿路上皮癌等多种实体瘤对PD-1/PD-L1抑制剂免疫治疗的疗效。

12. S-100蛋白

    • 原理：针对一种酸性钙结合蛋白，广泛分布于神经外胚层来源的细胞。

    • 方法：多克隆或单克隆抗体标记。

    • 意义：黑色素瘤、神经鞘瘤、胶质瘤等的标志物，亦在朗格汉斯细胞组织细胞增生症中表达。

二、检测范围

免疫组化的应用已超越传统病理学，延伸至多个对材料生物相容性与安全性有严格要求的领域，主要用于检测材料中残留的特定生物源性成分或评估其生物学效应。

1. 医疗器械：检测植入材料（如心脏瓣膜、人工关节）表面残留的动物源性蛋白（如α-Gal抗原），评估其免疫原性风险；检测一次性无菌医疗器械的细菌内毒素污染。

2. 食品接触材料：分析可能从包装材料迁移至食品中的过敏性蛋白质残留（如乳胶蛋白）、或用于验证包装材料抗菌涂层的有效性（如溶菌酶活性检测）。

3. 儿童玩具及用品：检测毛绒玩具填充物、皮革制品中可能引起过敏的特定动物毛绒蛋白或皮革鞣制剂残留蛋白。

4. 生物源性材料：如胶原蛋白海绵、明胶止血材料等，需检测其原料来源特异性蛋白，确保产品一致性与无交叉污染。

5. 化妆品：评估产品中生物活性成分（如EGF、胶原蛋白）的定位与渗透性，或检测可能污染的微生物毒素。

6. 药品包装系统：检测包装容器（如预灌封注射器）硅化层中可能存在的硅油残留及对其吸附的蛋白类药物的影响。

7. 组织工程产品：评估支架材料上种植细胞的表型维持、分化状态（如成骨细胞标志物Osteocalcin）及细胞外基质沉积情况。

8. 纳米生物材料：研究纳米颗粒在细胞或组织内的定位、摄取机制及其对细胞特定蛋白表达的影响。

9. 纺织品（医用纺织品/高端功能性纺织品）：检测经抗菌、抗病毒或生物相容性处理的纺织品表面功能性蛋白（如抗菌肽）的分布与稳定性。

10. 体外诊断试剂原材料：对用于制备校准品、质控品的生物源性材料（如血清、细胞裂解物）进行特定靶标蛋白的定性与半定量验证。

三、检测标准

为确保检测结果的准确性、可重复性与可比性，免疫组化操作需遵循严格的标准化流程，相关标准体系包括：

• GB/T（中国国家标准）与YY/T（医药行业标准）：

  • YY/T 1183-2023 《免疫组织化学试剂盒》：规定了试剂盒的分类、要求、试验方法，是试剂质量控制的国内核心标准。

  • GB/T 28624-2023 《免疫组织化学染色有效性判断通则》：提供了染色结果判读的一般原则与质控要点。

  • 针对特定应用领域，如医疗器械的生物相容性评价遵循GB/T 16886/ISO 10993系列标准，其中涉及免疫毒理学评估的部分可能用到免疫组化方法。

• ISO（国际标准化组织）标准：

  • ISO 19085-1:2017 系列中涉及病理学检测的部分为实验室质量提供了框架。ISO 15189:2022 《医学实验室—质量和能力的要求》 是确保包括免疫组化在内的医学检测质量管理的国际金标准。

  • ISO 13485:2016 《医疗器械 质量管理体系 用于法规的要求》 规范了相关检测实验室的体系管理。

• ASTM（美国材料与试验协会）标准：

  • ASTM F748-16 《选择用于评估医疗器械材料的测试方法的标准实践指南》 为选择包括免疫反应评估在内的测试方法提供指导。

  • ASTM F1983-14 《对医疗装置用材料的免疫反应评估标准指南》 直接涉及免疫反应测试，免疫组化可作为其中的观察手段。

• CAP（美国病理学家协会）指南：虽非强制性标准，但其发布的免疫组化实验室认可检查要点（如ASR、IVD试剂验证、每日阳性质控等）是全球病理实验室质控的行业标杆。

四、检测仪器

现代免疫组化实验室依赖于一系列精密仪器以确保流程标准化和结果一致性。

1. 全自动免疫组化染色仪：核心设备。采用微流控或毛细管间隙原理，自动完成烤片、脱蜡、抗原修复、阻断、一抗/二抗孵育、显色、复染等全过程。技术特点包括：高通量（一次性处理数十至数百张切片）、程序化控制（确保孵育时间、温度、试剂用量精确一致）、多任务并行（可同时运行不同染色程序）、软件控制与追溯系统。

2. 组织脱水机与包埋机：前处理关键设备。脱水机通过梯度酒精和二甲苯自动处理组织，完成脱水透明；包埋机则将浸蜡后的组织包埋于石蜡中形成蜡块。其温控精度和流程稳定性直接影响后续切片质量及抗原保存。

3. 石蜡切片机与冷冻切片机：切片机通过精密的微进样系统切割组织蜡块或冷冻组织，获得4-5μm（石蜡）或5-8μm（冷冻）的薄片。冰冻切片机需具备快速制冷（-20℃至-40℃）能力，用于术中快速病理及保存对热不稳定的抗原。

4. 摊片机与烤片机：摊片机将切片展开于温水中消除皱褶并贴附于载玻片上；烤片机通过恒温加热（通常60-65℃）使切片牢固附着，并可用于抗原修复前的脱蜡。

5. 抗原修复仪：用于恢复因甲醛固定而被遮蔽的抗原表位。主要分为高压热修复仪（高温高压蒸汽）和水浴热修复仪（恒温水浴/微波），其控温精度和压力稳定性是修复效果的关键。

6. 数字病理切片扫描仪：将染色后的玻片进行全视野高速、高分辨率扫描，生成数字切片图像。技术特点包括：全自动对焦与扫描、多种物镜倍率（20x， 40x）、高图像分辨率（达0.25μm/像素）、大容量图像存储与管理软件，为远程会诊、人工智能分析及结果数字化归档提供基础。

7. 荧光显微镜与共聚焦显微镜：用于观察荧光标记的免疫组化结果。荧光显微镜需配备特定波长激发块与滤镜；共聚焦显微镜利用激光扫描和针孔技术，可获得高分辨率、高对比度的光学切片图像，并进行三维重建，对亚细胞结构定位研究至关重要。

8. 实验室信息管理系统：整合样本流、数据流和信息流，实现从样本接收、任务分配、仪器控制、结果判读到报告发放的全流程信息化管理与质控追溯，是标准化实验室的“大脑”。