CCK-8/MTT

细胞毒性检测是评价生物材料与医疗器械安全性的核心技术手段，其中CCK-8与MTT法是两种基于细胞代谢活性定量分析的经典体外检测方法。它们通过不同的原理量化活细胞数量，从而间接反映测试材料的细胞毒性程度，在产品质量控制与安全性评估中具有不可替代的作用。

一、 主要检测项目及其原理、方法与意义

1. 细胞相对增殖率（RGR）检测：通过比较实验组与对照组的吸光度值，计算细胞增殖活性百分比。原理是活细胞线粒体酶还原MTT或CCK-8中的水溶性四唑盐生成甲臜或甲臜染料。方法是接种细胞、接触材料浸提液或样品后，加入检测试剂孵育，测定特定波长吸光度。意义在于直接量化细胞毒性等级，是基础评价指标。

2. 细胞存活率检测：与RGR类似，侧重评价材料接触后存活的细胞比例。采用CCK-8法时，水溶性甲臜染料直接溶于培养液，步骤更简便，适用于高通量筛选。

3. 半数抑制浓度（IC50）测定：测定抑制50%细胞增殖或活性的材料浸提液浓度。通过设置系列浓度梯度，绘制剂量-效应曲线计算得出。意义在于定量比较不同材料的毒性强度。

4. 细胞形态学观察（结合法）：在完成CCK-8/MTT检测后，对同一孔板细胞进行固定染色，光学显微镜观察。原理是毒性会导致细胞皱缩、脱落、空泡化等形态改变。方法上需先去除甲臜结晶或染料再固定。意义在于将定量数据与直观形态关联，增强结果可信度。

5. 时间-毒性关系检测：设置不同的接触时间点（如24h， 48h， 72h），进行CCK-8/MTT检测。原理是毒性作用具有时间累积效应。意义在于评估毒性的时效性，为实际使用周期提供参考。

6. 材料浸提液检测：将材料按标准比例浸提于培养介质中，用浸提液培养细胞并进行检测。模拟可溶出物毒性，是大多数标准规定的首选方法。

7. 材料直接接触检测：将材料样品直接放置于单层细胞上，加入少量培养基培养后检测。原理是评价材料在直接接触状态下的毒性，包括物理刺激与溶出物共同作用。

8. 材料间接接触（琼脂扩散/滤膜扩散）检测：在细胞与样品间覆盖一层琼脂或滤膜，毒性物质通过扩散作用于细胞。原理是模拟屏障下（如皮下植入）的毒性反应。方法需使用琼脂糖覆盖细胞层或Transwell小室。

9. 恢复性试验（Recovery Test）：将接触材料后的细胞更换为新鲜培养基继续培养一段时间（如24-48小时）后再检测。原理是评估细胞在移除毒性刺激后的恢复能力。意义在于区分可逆与不可逆的毒性损伤。

10. 线粒体功能特异性评估：MTT法特异性依赖于线粒体琥珀酸脱氢酶活性。当材料可能特异性影响线粒体功能时，MTT法的信号变化比CCK-8法（还涉及其他脱氢酶）更具指向性。

11. 三维细胞培养毒性检测：将细胞培养于三维支架中，用CCK-8法检测（因其产物水溶性，易于渗透）。原理是模拟更接近体内的细胞微环境。意义在于提升体外测试的生理相关性。

12. 协同/拮抗毒性效应筛选：在细胞培养中加入待测材料与已知药物的组合，通过CCK-8/MTT法评估细胞活性变化。用于筛选材料是否影响药效或产生联合毒性。

二、 检测应用领域

1. 食品接触材料：评估塑料、橡胶、涂层、纸张等包装材料中溶出的化学物质（如塑化剂、重金属、单体）的毒性。

2. 医疗器械：涵盖高分子耗材（导管、输液器）、植入物（骨科、齿科）、体外诊断设备组件等的生物相容性基础测试。

3. 儿童玩具及用品：检测玩具塑料、彩色涂料、橡皮泥等可迁移成分对儿童健康的潜在风险。

4. 药品包装材料：评价药用玻璃、橡胶塞、塑料瓶、铝箔等对药品稳定性的影响及自身溶出物毒性。

5. 生物医用材料：包括可降解缝合线、组织工程支架、水凝胶、纳米载药材料等在研发阶段的早期安全性筛选。

6. 化妆品及原料：评估化妆品成品、防腐剂、表面活性剂、纳米化妆品原料对皮肤细胞的潜在毒性。

7. 医用纺织品：检测手术衣、防护服、医用敷料中的化学残留及纤维脱落物对细胞的影响。

8. 电子电器产品：针对可能与人体长期接触的部件（如耳机套、可穿戴设备外壳），评估其材料溶出物。

9. 环境污染物筛查：用于水样、土壤浸提液中混合污染物的细胞毒性初步筛查与风险排序。

10. 口腔材料：专门用于牙科复合树脂、粘接剂、印模材料、种植体表面涂层等的生物安全性评价。

三、 检测标准体系

国际上普遍遵循ISO 10993系列（医疗器械生物学评价）和ISO 7405（牙科材料生物学评价）。具体到细胞毒性测试，核心标准包括：

• ISO 10993-5:2009 《医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》。该标准详细规定了浸提液制备、直接/间接接触法、定量（如MTT/CCK-8）与定性评价方法，是全球公认的权威标准。

• GB/T 16886.5-2017 / YY/T 0993-2015：中国国家标准与医药行业标准，等同或修改采用ISO 10993-5，适用于国内医疗器械注册检验。

• USP <87> 生物学反应性试验，体外：美国药典标准，要求使用小鼠成纤维细胞L929等进行测试，方法包括琼脂扩散法和MTT法等，是药品包装材料进入美国市场的常用依据。

• ASTM F813-20 《医疗器械材料直接接触细胞培养的标准化浸提液制备规程》和ASTM F895-84(2014) 《琼脂扩散细胞毒性评价方法》，提供了详细的材料处理和测试程序。

• GB 4806.1-2016 系列：中国食品接触材料安全标准，通用安全要求中明确需进行细胞毒性等生物学测试，通常参考GB/T 16886.5方法。

四、 主要检测仪器与技术特点

1. 酶标仪（微孔板读数仪）：核心检测设备。用于测定96孔板或384孔板在特定波长（如MTT：570nm，参比630nm；CCK-8：450nm）的吸光度。现代机型具备振板、温控、快速扫描及多种检测模式（吸光、荧光、发光）功能。

2. CO2恒温培养箱：为细胞培养和检测过程提供稳定的温度（37°C±1°C）、湿度（>90%）和CO2浓度（5%±1%）环境，确保细胞活性稳定。

3. 生物安全柜/超净工作台：提供无菌操作环境，防止细胞污染和操作者暴露于生物性风险，是样品处理、细胞接种、试剂添加的关键设备。

4. 倒置相差显微镜：用于检测前后的细胞形态学观察。配备数码成像系统可进行图像采集和定量分析，与CCK-8/MTT数据相互印证。

5. 精密电子天平与pH计：精确称量材料样品、配制浸提介质和试剂。精确测定并调节浸提液pH值至生理范围（7.2-7.4），避免因pH偏差导致的假阳性。

6. 离心机：用于细胞悬液制备、材料浸提液制备过程中的离心步骤，确保细胞均匀分布和浸提液澄清无颗粒。

7. 超声波清洗机/恒温振荡水浴锅：用于加速材料浸提过程。超声波可促进溶出，恒温振荡水浴可模拟生理条件下的持续动态浸提。

8. 自动化液体处理工作站：适用于高通量检测。可自动完成细胞接种、培养基更换、试剂添加等步骤，提高实验效率、精度和重现性，减少人为误差。

综上所述，CCK-8与MTT检测作为成熟的体外毒性评价体系，通过多样化的检测项目设计，结合标准化的操作流程与精密的仪器平台，为多领域材料产品的生物安全性提供了高效、定量、可靠的早期筛选与评价工具，是连接材料研发与临床前安全评估的重要桥梁。