Western免疫印迹

Western免疫印迹技术是一种将电泳分离的蛋白质组分转移至固相载体，并通过特异性抗体进行检测的分析方法。该技术具有高特异性、高灵敏度等特点，广泛应用于生物化学、医学诊断及材料科学等多个领域的蛋白质定性及半定量分析。

一、 检测项目

1. 总蛋白检测（如β-肌动蛋白，GAPDH）

   • 原理：使用针对看家蛋白的抗体作为内参，验证上样量的一致性及转移效率。

   • 方法：在同一张膜上，与目标蛋白同步或异步孵育内参抗体。

   • 意义：对目标蛋白信号进行均一化校正，确保实验结果可比性。

2. 磷酸化蛋白检测（如p-ERK1/2, p-Akt）

   • 原理：利用针对磷酸化氨基酸残基（如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）的特异性抗体进行识别。

   • 方法：需使用磷酸化蛋白特异性抗体，实验前后需使用磷酸酶抑制剂并严格控制条件。

   • 意义：揭示信号通路的激活状态，在细胞应激、药物效应研究中至关重要。

3. 凋亡相关蛋白检测（如Cleaved Caspase-3, PARP）

   • 原理：检测凋亡过程中被特异性切割的蛋白片段。

   • 方法：使用识别切割后新表位的抗体，可区分全长蛋白与活性片段。

   • 意义：评估细胞凋亡程度，用于毒理学评价及抗癌药物研发。

4. 炎症因子检测（如IL-6, TNF-α）

   • 原理：通过抗体识别样品中极低含量的炎症介质。

   • 方法：通常需浓缩样品，采用高灵敏度化学发光底物。

   • 意义：评价生物材料相容性、医疗器械致炎潜能及食品污染引发的免疫反应。

5. 应激反应蛋白检测（如HSP70, HO-1）

   • 原理：检测细胞在热、化学或氧化应激下诱导产生的蛋白。

   • 方法：对细胞或组织提取物进行检测。

   • 意义：评估材料或化学品的细胞毒性及安全性。

6. 外源性蛋白污染检测（如内毒素/LPS相关蛋白，微生物抗原）

   • 原理：使用针对特定病原体或污染源蛋白的抗体进行筛查。

   • 方法：直接对医疗器械洗脱液或材料浸提液进行免疫印迹。

   • 意义：确保医疗器械、食品接触材料无特定生物污染物。

7. 转基因成分检测（如外源CP4-EPSPS蛋白，Bt毒素蛋白）

   • 原理：特异性识别转基因作物表达的外源蛋白。

   • 方法：对食品或农产品提取物进行检测，需有合适的蛋白提取方案。

   • 意义：食品安全监管，标识管理。

8. 过敏原蛋白检测（如花生Ara h1，麸质蛋白）

   • 原理：针对食物中常见过敏原的表位进行检测。

   • 方法：从复杂食品基质中提取蛋白，进行电泳分离与免疫检测。

   • 意义：食品过敏原标识验证与交叉污染监控。

9. 受体与配体检测（如EGFR，VEGFR）

   • 原理：检测细胞表面或内部的受体蛋白表达水平。

   • 方法：制备膜蛋白或全细胞裂解液，使用特异性受体抗体。

   • 意义：疾病生物标志物研究，靶向治疗疗效评估。

10. 细胞骨架蛋白检测（如Tubulin, Vimentin）

    • 原理：评估细胞结构完整性。

    • 方法：检测细胞裂解液中的骨架蛋白含量。

    • 意义：反映材料或化学物质对细胞结构的破坏作用。

11. 自噬标志物检测（如LC3-II, p62）

    • 原理：LC3-II定位于自噬体膜，其含量与自噬体数量正相关；p62在自噬过程中被降解。

    • 方法：比较不同处理条件下LC3-II的转化及p62的积累。

    • 意义：评估细胞自噬流活性，用于神经退行性疾病、癌症等领域研究。

12. 翻译后修饰泛检测（如泛素化，乙酰化）

    • 原理：使用修饰特异性抗体显示蛋白修饰谱。

    • 方法：免疫沉淀后检测，或直接检测全细胞裂解液。

    • 意义：揭示蛋白功能调控机制。

二、 检测范围

该技术的应用范围已超越基础生命科学，延伸至多个工业与监管领域：

1. 食品接触材料：检测从材料中迁移至食品模拟物中的潜在致敏蛋白、树脂单体残留（如作为蛋白加合物）或微生物污染蛋白。

2. 医疗器械：评价植入物（如胶原支架）的蛋白质组成、残留的动物源蛋白（如戊二醛交联后残留的α-Gal抗原），以及材料引起的宿主炎症反应蛋白标志物。

3. 儿童玩具：检测玩具涂层、织物部件中的特定过敏原（如乳胶蛋白）或有害生物制剂污染。

4. 生物医药：重组蛋白药物（如单克隆抗体）的纯度分析、降解产物鉴定及一致性评价。

5. 化妆品安全：评估原料中可能含有的动物源性蛋白或生物工程蛋白的活性与安全性。

6. 纺织品：检测残留的加工酶制剂（如纤维素酶）或致敏性天然蛋白纤维。

7. 食品与农产品安全：转基因蛋白、过敏原、毒素蛋白（如黄曲霉毒素相关蛋白）及掺假蛋白（如乳制品中非乳源蛋白）的定性与半定量。

8. 环境监测：分析水体或土壤中特定微生物功能蛋白（如降解酶）作为生物标记物。

9. 法医学：鉴定极其微量的生物样本来源（如特定组织或体液的特异性蛋白标志物）。

10. 兽药与饲料：监测饲料中违禁动物源性蛋白成分（如肉骨粉）及重组生长激素的滥用。

三、 检测标准

Western免疫印迹作为核心分析技术，其操作与结果解释需遵循相关通用标准，并在特定领域结合产品标准。

• GB/T 33410-2016《生物样品中蛋白质印迹检测通则》：中国国家标准，规定了实验流程、试剂、设备及结果分析的基本要求，适用于各类生物样品的检测。

• ISO 19001:2018 (Under development/参考相关ISO)：关于免疫化学检测方法的一般原则的国际指南，为建立可靠的免疫印迹方法提供框架。在具体应用领域，需遵循如ISO 10993（医疗器械生物学评价） 系列标准中关于蛋白质吸附与免疫反应测试的相关部分。

• ASTM F2383-2011 (Reapproved 2019)： "评估血管植入物材料对蛋白质吸附作用的试验方法标准指南"，其中提及可采用免疫学方法（如免疫印迹）对吸附的特异性蛋白进行鉴定。

• 适用范围与要求：上述标准主要对方法学进行规范，要求实验室建立标准操作程序（SOP），包括：样品制备与保存规范、合适的阳性/阴性对照设置、电泳与转印条件优化、抗体特异性验证、图像采集与定量分析的线性范围确定，以及不确定度评估。在具体产品检测中，如食品过敏原检测，还需符合相应产品的限量标准与取样规定。

四、 检测仪器

1. 垂直电泳系统：提供蛋白质按分子量分离的电场环境。关键特性包括恒压/恒流/恒功率输出模式，以及良好的散热设计以确保条带锐利。

2. 半干式与湿式转印系统：

   • 半干转印仪：利用滤纸堆叠产生电场，速度快、缓冲液用量少，适用于多数常规蛋白。

   • 湿式转印仪：蛋白在充满缓冲液的槽内转移，冷却效果好，适用于大分子量（>150 kDa）或难转印蛋白，转移效率更均一。

3. 全自动免疫印迹处理系统：集成封闭、孵育、洗涤步骤，实现流程标准化，极大减少人工操作差异与接触风险，提高通量和重现性。

4. 化学发光成像系统：核心检测设备。配备高分辨率CCD或CMOS相机，具有低暗电流、高动态范围特性，可捕获极微弱化学发光信号。具备多色荧光检测能力的系统可实现同一张膜上多靶标同步分析。

5. 近红外荧光成像系统：使用红外荧光染料标记的二抗，在近红外通道检测。背景极低，动态范围宽，适合高精度定量及多重检测。

6. 多功能酶标仪：配备化学发光与荧光检测模块，可对印迹膜或溶液中的免疫复合物进行定量，尤其适用于线性范围标定。

7. 激光扫描成像仪：使用激光激发荧光染料，灵敏度极高，分辨率优异，是定量蛋白质组学研究的优选设备之一。

8. 毛细管电泳免疫分析系统：将毛细管电泳分离与激光诱导荧光检测相结合，实现超微量蛋白（飞克级）的自动化、定量免疫分析，正逐渐应用于高要求检测领域。

Western免疫印迹技术凭借其不可替代的特异性与灵活性，持续在科研与产业质量控制中扮演关键角色。随着自动化设备、高灵敏度检测模式及标准化流程的不断发展，其在各应用领域的检测能力与可靠性将得到进一步提升。