乳酸菌检测

乳酸菌作为一类具有重要生理功能的革兰氏阳性、通常过氧化氢酶阴性的细菌，其检测在食品工业、保健品、医疗及材料抗菌评估等领域至关重要。准确可靠的检测技术是确保产品质量、安全性和功能声称科学有效的基础。

检测项目

乳酸菌检测包含多个维度的分析项目，旨在确认菌株身份、活性、纯度及功能特性。

1. 菌落总数测定：采用平板计数法。原理是基于每个活的微生物细胞在适宜的固体培养基上生长繁殖形成一个可见的菌落。通过系列稀释和培养，计算菌落形成单位（CFU）。这是评估产品中乳酸菌活菌数量的核心指标。

2. 乳酸菌属/种鉴定：结合生理生化鉴定与分子生物学方法。生理生化法依据糖发酵、酶活等表型特征。分子鉴定则通过165 rRNA基因序列分析，具有更高的准确性和分辨率，是确认菌株分类地位的金标准。

3. 嗜热链球菌特异性检测：针对发酵乳制品中的关键菌种。使用选择性培养基（如M17培养基）和特定培养条件（如37℃需氧培养），并结合种特异性PCR进行验证，以区分其他链球菌和乳杆菌。

4. 乳杆菌与双歧杆菌比例分析：采用选择性计数法。利用不同菌属的生理差异，如双歧杆菌对NNLP（新霉素、萘啶酮酸、锂盐、巴龙霉素）的选择性抗性，分别在改良MRS培养基和TPY培养基上进行计数，计算两者比例，评估复合益生菌制剂的菌群构成。

5. 污染微生物检查：包括霉菌、酵母菌计数（使用孟加拉红培养基或PDA培养基）、大肠菌群/大肠杆菌检测（采用MPN法或VRBA培养基）、金黄色葡萄球菌检测（Baird-Parker平板法）和沙门氏菌检测（选择性增菌与分离）。确保产品的微生物安全性。

6. 耐药性检测：通过纸片扩散法或最低抑菌浓度（MIC）测定法，评估乳酸菌对常用抗生素的敏感性。这对于确保益生菌的安全性，避免耐药基因水平转移至关重要。

7. 产酸能力测定：使用滴定法（以酚酞为指示剂，用NaOH滴定）或pH计直接测量。定量检测乳酸菌在特定时间内产乳酸的能力，是其发酵活性的直接体现。

8. 耐酸耐胆盐试验：模拟胃肠环境。将菌体分别暴露于pH 2.5-3.0的盐酸溶液和一定浓度（如0.3%）的牛胆盐溶液中，作用一定时间后检测存活率。用于评价菌株通过上消化道到达肠道的潜在能力。

9. 细菌素等抑菌物质检测：采用琼脂扩散法。将指示菌（如李斯特菌）涂布平板，中央加入乳酸菌发酵上清液或提取物，观察抑菌圈。评估菌株的抗菌功能特性。

10. 胞外多糖产量测定：采用苯酚-硫酸法。利用多糖在浓硫酸作用下水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚生成橙黄色化合物，在490nm波长下比色定量。这与产品的质构和功能相关。

11. 基因稳定性检测：通过传代培养（如连续传代50-100代），结合随机扩增多态性DNA（RAPD）或重复序列PCR（rep-PCR）技术，比较原始菌株与传代后菌株的基因型一致性，确保生产菌株的遗传稳定性。

12. 肠道定植能力初步评估：通常使用体外黏附试验，如检测菌体对肠上皮细胞系（如Caco-2细胞）的黏附率。通过显微镜计数或荧光标记定量，间接评估其潜在定植能力。

检测范围

乳酸菌检测技术广泛应用于以下领域：

1. 发酵乳制品：酸奶、发酵乳饮料、干酪等，检测活菌数与菌种真实性。

2. 益生菌制剂：粉剂、胶囊、片剂等膳食补充剂，全面评估活菌数、菌种鉴定、功能性与安全性。

3. 发酵食品：泡菜、香肠、发酵豆制品等，监控发酵过程与品质。

4. 食品接触材料：评估宣称含乳酸菌抗菌成分的活性包装材料中乳酸菌的活性与释放效能。

5. 饲料添加剂：用于畜禽水产的益生菌饲料，检测有效活菌及杂菌污染。

6. 医疗器械：评估含乳酸菌的生物敷料或妇科栓剂等产品中功能菌的活性、纯度和安全性。

7. 儿童玩具与日用品：针对宣称添加益生菌用于表面抗菌的玩具、毛巾等，进行安全性及有效性验证。

8. 化妆品：用于宣称具有皮肤微生态调节功能的护肤品，检测相关乳酸菌的活性与稳定性。

9. 药品：作为活性成分的活菌制剂（如某些止泻药），需符合药品级的严格质控标准。

10. 环境样本：研究土壤、水体及动物肠道等自然环境中的乳酸菌菌群多样性。

检测标准

检测工作严格遵循国内外标准体系以确保结果的准确性与可比性。

• 中国国家标准（GB）：

  • GB 4789.35-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》：规定了食品中乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌及嗜热链球菌的计数与鉴定方法，是国内食品检测的核心依据。

  • GB/T 31118-2014 《益生菌乳酸菌类产品中乳酸菌的计数方法》 等。

• 国际标准（ISO）：

  • ISO 7889|IDF 117: Yogurt — Enumeration of characteristic microorganisms — Colony-count technique at 37 °C. 针对酸奶特征菌的计数。

  • ISO 20128|IDF 192: Milk products — Enumeration of presumptive Lactobacillus acidophilus on a selective medium — Colony-count technique at 37 °C. 提供嗜酸乳杆菌的选择性计数方法。

• 美国材料与试验协会标准（ASTM）：

  • ASTM F2808 - 10：涉及评估抗菌活性与活性的标准试验方法，可用于评估含乳酸菌材料的抗菌性能。

• 药典标准：

  • 《中华人民共和国药典》通则1105、1106等微生物限度检查法，适用于作为药品管理的乳酸菌制剂。

• 行业与团体标准：如中国乳制品工业协会规范等，对特定产品（如益生菌粉）的活菌数、水分、贮存稳定性等提出更细致要求。

检测仪器

精准的检测依赖于先进的仪器设备。

1. 全自动菌落计数仪：采用高分辨率摄像头和智能图像分析软件，自动识别并统计平板菌落数，大幅提高计数效率和准确性，减少人为误差。

2. 实时荧光定量PCR仪：用于乳酸菌的快速、定量鉴定。通过针对特定菌种的探针或染料，实现对目标菌DNA的绝对或相对定量，灵敏度极高，且无需培养。

3. 微生物质谱鉴定系统（MALDI-TOF MS）：通过分析菌体蛋白指纹图谱，数分钟内完成对乳酸菌分离株的快速种级鉴定，通量高，成本相对较低。

4. 全自动微生物生化鉴定系统：基于微量生化反应原理，通过数据库比对，自动完成乳酸菌及其他污染菌的生化鉴定。

5. 厌氧/微需氧培养系统：包括厌氧工作站和厌氧罐，能为双歧杆菌等严格厌氧菌的培养提供精确的低氧环境（如含5% CO₂、10% H₂、85% N₂的混合气体），是确保其正常生长的关键。

6. 生物显微镜及成像系统：用于观察乳酸菌的形态（杆状、球状）、排列方式及纯度检查，是初步鉴别的必要工具。

7. 流式细胞仪：结合特异性荧光染色（如SYTO 9/PI区分活死菌），无需培养即可在数分钟内对样品中的总菌、活菌进行快速计数，尤其适用于难以培养或处于胁迫状态的菌体检测。

8. 高效液相色谱仪：用于定量分析乳酸菌发酵液中的有机酸（乳酸、乙酸等）、糖类及细菌素等代谢产物，精确评估其代谢活性。

9. 紫外-可见分光光度计：用于测量菌液浓度（OD600）、胞外多糖含量测定（苯酚-硫酸法）以及某些酶活性的比色分析。

10. 恒温恒湿培养箱与稳定性试验箱：提供稳定、均匀的培养环境，并进行产品的加速稳定性试验（如37℃/75%RH），评估活菌数在贮存期的衰减情况。

乳酸菌检测是一个多技术集成的严谨过程。随着分子生物学、光谱学和流式细胞术的发展，检测技术正朝着更快速、更精准、更高通量的方向发展，为各相关行业的质量控制与产品创新提供坚实的技术支撑。