SDS-PAGE染色

聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）染色技术是蛋白质分析领域的基石，它通过特异性染色使分离后的蛋白质条带可视化，进而实现定性、半定量及分子量测定。染色技术的选择直接影响检测的灵敏度、线性范围和背景干扰。

一、检测项目

1. 蛋白质分子量测定：基于蛋白质在SDS存在下电荷被掩盖、形状呈棒状，其迁移率与分子量对数成反比的原理。使用已知分子量的标准蛋白绘制标准曲线，可精确计算待测蛋白分子量。这是验证重组蛋白表达、分析蛋白降解的核心手段。

2. 蛋白质纯度评估：通过对单一目标条带在总蛋白条带中占比的灰度分析，评估样品纯度。对于生物制剂，高纯度是安全性和有效性的基本保障。

3. 蛋白质表达量分析（半定量）：通过比较对照与实验样品中目标条带的染色强度，结合图像分析软件，可对蛋白质的表达变化进行半定量分析，广泛应用于差异表达研究。

4. 二硫键分析：通过对比还原（加入β-巯基乙醇或DTT）和非还原（不加入还原剂）条件下的电泳图谱，判断蛋白质分子内或分子间是否存在二硫键及其连接方式。

5. 蛋白降解与碎片化检测：高灵敏度染色可识别由酶解、化学或物理应力产生的小分子量碎片条带或涂抹条带，用于评估蛋白质产品的稳定性。

6. 多聚体与复合物检测：非还原SDS-PAGE可检测由二硫键或强相互作用形成的蛋白质多聚体，对于抗体药物等的质量控制至关重要。

7. 翻译后修饰初步筛查：磷酸化、糖基化等修饰会改变蛋白质的表现分子量，导致条带迁移异常或弥散，可作为进一步质谱分析的预筛查。

8. 免疫印迹（Western Blot）前处理：SDS-PAGE是Western Blot的分离步骤，其分离效果和转印效率直接影响后续免疫检测的特异性和灵敏度。

9. 批次间一致性检验：在生产质量控制中，比较不同批次产品的SDS-PAGE图谱，确保生产工艺的稳定性和产品的均一性。

10. 相互作用蛋白共沉淀验证：在免疫共沉淀或pull-down实验后，通过SDS-PAGE分析洗脱组分，验证潜在的蛋白-蛋白相互作用。

11. 酶原激活鉴定：酶原激活常伴随分子量的减少，通过比较激活前后的条带迁移变化，可以明确激活过程是否发生。

12. 交叉污染监测：检测样品中是否含有非预期的宿主细胞蛋白（HCP）残留或培养基成分，是生物制品安全性的关键指标。

13. 抗原性分析：制备用于动物免疫的抗原时，SDS-PAGE可评估抗原的组成和相对含量，为抗体产生效果提供预判。

二、检测范围

1. 食品接触材料：检测从橡胶、塑料、涂层中迁移出的蛋白质类致敏原。

2. 医疗器械：分析胶原蛋白敷料、可吸收缝合线、酶清洗剂等生物源性材料的蛋白组成与残留。

3. 儿童玩具：检测毛绒、皮革玩具中可能含有的动物源性蛋白过敏原。

4. 生物医药：单克隆抗体、疫苗、细胞因子、血液制品等重组或天然蛋白质药物的质控放行。

5. 科研与诊断：基础研究中的蛋白表达分析，诊断试剂盒中抗原/抗体的纯度鉴定。

6. 化妆品：评估胶原蛋白、弹性蛋白等功能性蛋白原料的分子量及纯度。

7. 转基因产品：检测外源基因表达的蛋白质产物。

8. 司法鉴定：毛发、血液、组织等生物检材的种属来源蛋白分析。

9. 环境监测：分析生物酶制剂在环境样品中的残留与活性。

10. 饲料与宠物食品：监控动物源性蛋白成分的组成，防止违禁添加。

三、检测标准
检测必须遵循相关技术规范，确保结果的可比性与权威性。

• ISO/TS 19620:2018《生物技术 - 蛋白质纯度和稳定性分析 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法》：提供了SDS-PAGE的通用技术框架。

• ASTM E3006-15《评估蛋白质凝胶电泳用染色剂的标准指南》：详细规范了染色剂的性能评估方法。

• 《中华人民共和国药典》（ChP） 通则0541第五法“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法”，是药品检验的强制性标准。

• GB/T 35809-2018《蛋白质凝胶电泳测试方法》：中国国家标准，规定了实验方法的基本要求。

• ISO 20418-1:2018《纺织品 - 某些动物毛发纤维的定性和定量蛋白质组分析 - 第1部分：使用LC-ESI-MS进行肽检测》：SDS-PAGE常作为该流程的前处理步骤。

• YY/T 0616.1-2018《一次性使用医用手套 第1部分：生物学评价要求与试验》中，蛋白质残留检测可参考凝胶电泳方法。
  适用时，具体产品标准（如针对单抗的ICH Q6B指南）会对SDS-PAGE的分辨率、灵敏度、上样量等提出更明确要求。

四、检测仪器

1. 垂直板电泳系统：核心分离设备，采用夹心式结构，确保凝胶均匀聚合和电场稳定。关键参数包括凝胶尺寸（迷你型、标准型）、同时运行数量以及冷却能力，后者影响高电流下电泳的重复性。

2. 高精度电源：提供恒定电压、电流或功率。进行复杂实验如双向电泳时，需具备程序化步进控制功能，以实现精确的电压/电流转换和时间控制。

3. 凝胶成像系统：由暗箱、CCD或CMOS相机、紫外/白光透射仪及分析软件组成。高动态范围、低噪声的冷CCD相机能捕获弱至强所有信号。软件需具备条带检测、分子量计算、密度积分等定量功能。

4. 激光扫描仪：用于荧光染色凝胶（如SYPRO Ruby）的高灵敏度检测。通过激光激发，光电倍增管（PMT）检测发射光，具有灵敏度高、线性范围宽（超过3个数量级）的优点。

5. 全自动凝胶染色/脱色仪：通过编程控制摇动、抽吸、加液过程，实现染色、固定、脱色步骤的标准化与高通量化，极大减少人工操作差异和试剂暴露。

6. 图像分析工作站：配备专业凝胶分析软件，能进行多泳道比对、背景扣除、归一化处理，并生成符合GMP/GLP要求的审计追踪报告。

7. 凝胶干燥仪：通过加热和真空抽吸将凝胶永久固定在亲水支撑膜上，便于长期存档。温控精度和真空度是关键指标。

8. 凝胶切片仪：用于质谱前处理，可精确切取目标蛋白条带，避免交叉污染，提高下游蛋白质鉴定成功率。

染色方法的选择取决于具体需求：考马斯亮蓝法（检测限约50-100 ng）经济快速，适用于高丰度蛋白；银染法（检测限1-5 ng）灵敏度高但线性差；荧光染色法（如SYPRO Ruby，检测限2-10 ng）则兼具高灵敏度与宽线性范围。在实际应用中，需结合检测项目、样品特性及标准要求，系统优化电泳条件与染色方案，以获得准确可靠的蛋白质分析结果。