蛋白的原核表达与纯化

蛋白的原核表达与纯化是生物技术研究与产业化的核心技术路径之一，其产物广泛应用于生物医药、体外诊断、工业酶制剂及材料科学等领域。该流程的质控体系至关重要，需通过一系列严格的检测项目确保重组蛋白的活性、纯度与安全性，以满足不同应用领域的法规与性能要求。

一、 检测项目
针对原核表达纯化得到的重组蛋白，需进行以下关键检测，以确保其符合预定用途：

1. 浓度测定

   • 原理：基于蛋白质与特定染料（如考马斯亮蓝）的显色反应（Bradford法），或其在280 nm处的紫外吸收特性（A280法，依赖于色氨酸和酪氨酸残基）。

   • 方法：使用分光光度计测量样品在特定波长下的吸光度，通过标准曲线计算浓度。

   • 意义：是蛋白定量、剂量确定及后续实验配比的基础。

2. 纯度分析（SDS-PAGE）

   • 原理：在十二烷基硫酸钠和还原剂存在下，蛋白质按分子量大小在聚丙烯酰胺凝胶中分离。

   • 方法：电泳后通过考马斯亮蓝或银染染色，利用凝胶成像系统分析条带。

   • 意义：直观评估蛋白样品中目标蛋白的占比及非目标蛋白杂质（如宿主蛋白、蛋白酶解片段）的情况。

3. 纯度与杂质定量（高效液相色谱，HPLC）

   • 原理：基于分子大小（凝胶过滤色谱，SEC-HPLC）或疏水性（反相色谱，RP-HPLC）等特性进行分离。

   • 方法：样品经色谱柱分离，通过紫外或荧光检测器分析峰形与面积。

   • 意义：SEC-HPLC可分析聚合体或片段；RP-HPLC可检测细微的化学修饰或降解产物。提供比SDS-PAGE更精确的定量纯度数据。

4. 分子量确认（质谱分析，MS）

   • 原理：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）或电喷雾电离质谱（ESI-MS）使蛋白离子化并测量其质荷比。

   • 方法：将纯化后的蛋白样品进行质谱分析，获得精确分子量。

   • 意义：确认目标蛋白的分子量与理论值一致，检测是否存在翻译后修饰（如乙酰化）或错误翻译。

5. 等电点测定（等电聚焦，IEF）

   • 原理：蛋白质在pH梯度凝胶中电泳，迁移至其净电荷为零的pH位置（等电点，pI）。

   • 方法：使用预制IEF胶条或凝胶进行电泳，特定染色后成像分析。

   • 意义：验证蛋白的电荷异质性，判断脱酰胺或其他电荷变体的存在，对离子交换纯化工艺有重要指导意义。

6. 内毒素检测（鲎试剂法，LAL）

   • 原理：利用鲎血变形细胞裂解物中的酶系统，与细菌内毒素发生凝集或显色反应。

   • 方法：凝胶法、浊度法或显色基质法。

   • 意义：内毒素是革兰氏阴性菌宿主表达系统中的主要热原污染物，对于医用蛋白至关重要，必须严格控制。

7. 宿主蛋白残留（酶联免疫吸附试验，ELISA）

   • 原理：利用抗宿主蛋白的特异性抗体进行双抗体夹心法检测。

   • 方法：将样品加入包被抗体的微孔板中，通过酶标二抗与底物显色进行定量。

   • 意义：定量检测纯化过程中残留的大肠杆菌等宿主菌的蛋白质，是生物制品安全性的关键指标。

8. 宿主核酸残留

   • 原理：利用荧光染料（如PicoGreen）特异性结合双链DNA并产生荧光信号，或通过定量PCR（qPCR）扩增特定宿主DNA序列。

   • 方法：荧光光度法或qPCR法。

   • 意义：控制外源性DNA残留，降低潜在风险（如致瘤性、免疫原性）。

9. 生物学活性测定

   • 原理：基于蛋白特定的生物学功能，如酶促反应速率、细胞增殖抑制、受体结合竞争等。

   • 方法：建立相应的体外生化分析、细胞学分析或配体-受体结合分析。

   • 意义：直接证明重组蛋白具有预期的功能，是衡量其效价的“金标准”。

10. 二级结构分析（圆二色光谱，CD）

    • 原理：蛋白质中手性结构（如α-螺旋、β-折叠）对左右圆偏振光吸收不同，产生特征光谱。

    • 方法：在远紫外区（190-250 nm）扫描样品溶液，获得CD谱图，计算各二级结构含量。

    • 意义：评估蛋白的高级结构正确性及折叠状态，监测储存或处理过程中的结构变化。

11. 聚集状态分析（动态光散射，DLS）

    • 原理：测量溶液中粒子布朗运动引起的散射光强度波动，推算其流体力学半径分布。

    • 方法：将蛋白样品置于比色皿中，使用DLS仪器进行测量。

    • 意义：快速评估蛋白样品中单体、寡聚体及大颗粒聚集体的存在与分布，对制剂稳定性研究尤为重要。

12. 无菌检查

    • 原理：将样品接种于适宜的培养基中，培养以检测是否有微生物生长。

    • 方法：直接接种法或薄膜过滤法，遵循药典规定。

    • 意义：确保终产品不含活菌，是注射用或植入用蛋白产品的强制性安全检测。

二、 检测范围（应用领域）
重组蛋白的质控要求因其应用领域而异，主要涵盖以下十个方面：

1. 生物制药：治疗性抗体、细胞因子、疫苗抗原等，要求极端严格，需符合药品生产质量管理规范（GMP）。

2. 体外诊断试剂：作为校准品、抗原或抗体，对批间一致性和活性有高要求。

3. 医疗器械：用于涂层（如抗凝血涂层）、载药或组织工程支架的功能性蛋白。

4. 食品接触材料：评估材料中可能迁移出的、来自微生物工程菌生产的酶制剂或其他蛋白质成分。

5. 儿童玩具：检测玩具材料（尤其是毛绒、塑料）中可能含有的、作为添加剂或残留的蛋白过敏原。

6. 化妆品：评估添加的生长因子、酶类或其他功能性蛋白的安全性与有效性。

7. 工业酶制剂：用于洗涤、纺织、造纸等行业的酶，需检测其活性、稳定性及特定杂质。

8. 农业生物技术：作为生物农药或植物生长调节剂的蛋白，需评估其环境安全性与效价。

9. 科研试剂：用于基础研究的工具蛋白，需保证其功能的准确性与数据的可靠性。

10. 兽药与饲料添加剂：相关治疗或促生长蛋白，需满足动物用产品的安全与效能标准。

三、 检测标准
不同应用领域遵循不同的标准体系：

• GB（中国国家标准）：如GB 4789.43《食品安全国家标准 食品微生物学检验 微生物源酶制剂抗菌活性的测定》适用于食品工业用酶；GB/T 16886（等同采用ISO 10993）系列标准用于医疗器械的生物评价。

• ISO（国际标准化组织）：如ISO 13022《医疗产品中含动物源材料的风险管理》涉及蛋白类材料；ISO 11133/11135涉及培养基及灭菌验证，与无菌检查相关。

• ASTM（美国材料与试验协会）：如ASTM F756《评估材料溶血性能的标准实践》涉及与血液接触的蛋白材料。

• 各国药典：如《中国药典》（ChP）、美国药典（USP）、欧洲药典（EP），对作为原料药或制剂的重组蛋白有强制性的通则与各论要求，涵盖鉴别、纯度、含量、活性、内毒素、无菌等全方位检测。

• ICH指导原则：如ICH Q6B《生物技术/生物制品质量标准：检定方法和验收标准的规定》，为生物技术产品的质量检定提供了国际协调框架。

四、 主要检测仪器

1. 紫外-可见分光光度计：用于蛋白浓度（A280）、部分活性检测（如酶动力学）及部分杂质（如核酸A260/A280比值）的快速测定。

2. 凝胶成像系统：整合光源、滤光片和CCD相机，用于对SDS-PAGE、IEF等凝胶进行高灵敏度、定量的图像捕获与分析。

3. 高效液相色谱系统（HPLC/UPLC）：核心纯度分析工具。配备不同检测器（UV， DAD， FLD）和色谱柱（SEC， RP， IEX），实现高分辨率分离与定量。

4. 质谱仪：分子量确认与微量杂质鉴定的关键设备。MALDI-TOF MS适用于快速分子量筛查；高分辨率ESI-Q-TOF或Orbitrap MS可进行肽图分析、翻译后修饰鉴定及深度表征。

5. 酶标仪：进行ELISA、细胞活性（MTT/CCK-8）及部分荧光/化学发光法检测的高通量平台。

6. 圆二色光谱仪：用于蛋白质溶液状态二级结构研究的专用光谱设备，对样品浓度和透明度有特定要求。

7. 动态光散射仪：快速、无损地表征蛋白质流体力学半径与粒径分布，评估溶液聚集状态。

8. 实时荧光定量PCR仪：高灵敏度、定量检测宿主DNA残留的核心设备，通常要求达到pg/mL级别的检测限。

综上所述，原核表达重组蛋白的质量控制是一个多维度的系统性工程。从基础的理化性质到高级结构，从工艺相关杂质到生物学功能，均需依托先进的检测技术与设备，并严格参照相应的法规与标准，才能确保最终产品安全、有效、质量可控，满足从实验室到广泛工业应用的需求。