骨骼肌细胞大鼠模型

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　　动物品系：SD大鼠

　　实验分组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组低、中、高三个剂量组

　　实验周期：6~8weeks

　　建模方法：

　　1 . 组织取材 SD 大鼠乙醚吸入麻醉后腹腔内注射氯胺酮(22 mg/kg)。 以左侧第 4 肋水平作横切口, 取胸大肌约 1 cm3 , 并将其修剪成 1 mm3 大小的肌小粒 。反复用Hanks 液洗去血细胞 , 将肌小粒小心贴附于事先用明胶包被的细胞培养瓶底部 , 加入适量成肌细胞增殖培养液(Ham' s F-10 培养基中加入15 %小牛血清、青霉素100 U/ml 、链霉素 100 U/ml)。将瓶底向上轻置于37℃、5 %CO2 、饱和湿度的培养箱中, 4 h 后轻轻翻转培养瓶 , 使肌小粒浸浴于培养液中。 3 d 换液一次 , 待细胞长满瓶底即可传代。

　　2 .成肌细胞的培养 采用组织块培养法贴块 2 d 后即可见有细胞从肌小粒边缘爬出 , 细胞呈梭形, 胞浆透明。1 周后细胞可长满瓶底的 60 %～ 70 %, 其数目可达 105 , 此时细胞可呈多角形 , 充分伸展, 部分细胞密集区可见细胞呈向心性生长 , 相互间排列整齐 , 类似骨骼肌的纵切面。

　　3 .成肌细胞的分化鉴定 将传代后的细胞接种至 6 孔板, 加入增殖培养液 , 待细胞长至80 %满时, 换入成肌细胞诱导分化液(低糖DMEM培养基中加入 2 %马血清、0 .5%鸡胚提取物、青霉0100 U/ml 、链霉素 100 U/ml), 换用诱导分化液后细胞可在 3 d 内分化 , 融合交织形成肌纤维, 可观察到收缩现象;并且部分细胞分化形成细长的肌管, 高倍镜下可见多个核及核分裂象。这些现象为成肌细胞所特有, 可以作为简便的鉴定方法。

　　4.成肌细胞的免疫荧光鉴定

　　免疫荧光在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min;用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min;0.5%Triton X-100( PBS配

　　制 )室温通透20min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min。水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗(Desmin结蛋白)并放入湿盒，4℃孵育过夜;加荧光二抗：PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min。滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI;用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

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