志贺菌检测

志贺菌属（Shigella）是一类革兰氏阴性、无芽孢、无动力的兼性厌氧杆菌，是细菌性痢疾（志贺菌病）的主要病原体。由于其感染剂量极低，在公共卫生、食品安全及消费品安全领域具有高度风险。对其准确、高效的检测是预防和控制疾病爆发的关键环节。

检测项目

志贺菌检测是一个系统性工程，涵盖从初步筛选到最终确认及分型的多个环节，主要检测项目如下：

1. 增菌培养：样品经缓冲蛋白胨水（BPW）或志贺菌增菌肉汤进行非选择性预增菌，旨在修复受损菌体并增加目标菌数量。随后转接至革兰氏阴性菌（GN）增菌液或志贺菌选择性增菌液进行选择性增菌，抑制杂菌生长，提高志贺菌的相对比例。这是所有后续检测的基础。

2. 选择性分离：将增菌液划线接种于志贺菌选择性平板，如木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂、麦康凯（MAC）琼脂、希夫氏志贺菌（SS）琼脂或赫克通（Hektoen， HE）琼脂。志贺菌通常表现为不发酵乳糖的透明或淡粉色菌落（XLD上呈红色），与沙门氏菌等区分。

3. 生化鉴定：挑取可疑菌落进行系列生化试验。核心项目包括：三糖铁（TSI）琼脂试验（斜面碱性/底层酸性，不产气，不产H₂S）；动力试验（无动力）；脲酶试验（阴性）；以及利用商品化生化鉴定系统（如API 20E）检测葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等碳水化合物的发酵情况。志贺菌通常甘露醇发酵能力各异（宋内志贺菌阳性，痢疾志贺菌阴性），吲哚试验结果因种而异。

4. 血清学凝集试验：生化初步符合的菌株，使用志贺菌属多价及单价因子血清进行玻片凝集试验，以确定血清群和血清型。这是确诊志贺菌并分型（分为A群痢疾、B群福氏、C群鲍氏、D群宋内）的关键步骤。

5. 分子生物学鉴定（PCR法）：针对志贺菌特异性基因序列（如侵袭性质粒抗原H基因 ipaH，该基因在染色体和质粒上均存在，稳定性高）设计引物进行PCR扩增。该方法快速、灵敏，尤其适用于难以培养或混合菌群严重的样品直接筛查。

6. 实时荧光定量PCR（qPCR）：在PCR基础上加入荧光探针（如TaqMan探针），可对 ipaH 等靶基因进行实时定量检测，不仅能定性确认，还能评估细菌载量，具有极高的灵敏度和特异性，检测时间可缩短至数小时。

7. 免疫学快速检测（如酶联免疫吸附法ELISA、侧向层析试纸条）：利用志贺菌特异性抗原（如脂多糖O抗原）与抗体结合的原理，开发出快速检测试剂盒。适用于现场初筛和批量样本的快速筛查，但可能存在交叉反应，需用标准方法验证。

8. 毒力基因检测：通过PCR或基因芯片技术，检测与志贺菌侵袭性相关的毒力基因，如 ial（侵袭相关位点）、 *set1A/B*（志贺毒素基因，某些菌株携带）、 virA 等。这对于评估分离株的致病潜力至关重要。

9. 脉冲场凝胶电泳（PFGE）：在爆发调查中，利用稀有切割限制性内切酶对细菌全基因组DNA进行酶切，产生大片段DNA，通过脉冲场电泳分离形成特征性指纹图谱。PFGE是分子分型“金标准”，用于追踪传染源、确定菌株间的同源性。

10. 多位点序列分型（MLST）：通过对7个左右看家基因位点进行测序，比较其等位基因谱，确定菌株的序列型（ST）。该方法重复性好，便于全球数据库比对，适用于长期流行病学监测和种群遗传学研究。

11. 全基因组测序（WGS）：对细菌全基因组进行测序分析，可提供最全面的遗传信息，包括血清型预测、毒力基因谱、耐药基因谱以及高分辨率的系统发育分析，正逐渐成为爆发调查和溯源研究的终极工具。

12. 药物敏感性试验：采用肉汤稀释法或琼脂稀释法，测定分离株对临床常用抗生素（如氨苄西林、环丙沙星、阿奇霉素、第三代头孢菌素等）的最小抑菌浓度（MIC），指导临床治疗并监测耐药性流行趋势。

检测范围

志贺菌检测的应用范围广泛，主要涵盖以下领域：

1. 食品及其原料：特别是即食蔬果、沙拉、生食水产品、乳制品、禽肉制品等，因可能受到粪便污染或加工过程交叉污染而成为重点监控对象。

2. 食品接触材料：包括餐具、厨具、食品包装材料、加工设备表面等，其微生物卫生状况直接影响食品安全。

3. 生活饮用水及包装饮用水：水源性传播是志贺菌病的重要途径，对出厂水、管网末梢水及瓶装/桶装水需进行严格检测。

4. 医疗环境与医疗器械：住院患者粪便、医院污水、内镜等重复使用的医疗器械，尤其是儿科和消化科病房，是防控院内感染的重点。

5. 儿童玩具及用品：婴幼儿常将玩具放入口中，对塑料、橡胶、毛绒等材质的玩具，特别是可入口玩具，需检测微生物指标。

6. 日用消费品：如个人护理用品（湿巾）、厨房清洁海绵/抹布等，潮湿环境易滋生细菌。

7. 公共卫生环境样本：包括公共场所（如餐厅、学校、游乐场）的卫生间表面、门把手、游乐设施涂抹样等。

8. 化妆品及个人护理产品：特别是含水配方且使用于口唇附近或手部的产品，如口红、洗手液等。

9. 中药材及原料：在种植、加工、储存过程中可能受到粪便污染，需进行微生物限度检查。

10. 生物安全与应急监测：在疫情爆发、自然灾害后，对可疑污染源和环境进行快速检测与评估。

检测标准

全球主要标准体系对志贺菌检测均有明确规定，确保检测结果的准确性、可比性和可靠性。

• 中国国家标准（GB）：

  • GB 4789.5-2012 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》：中国食品中志贺菌检测的强制性标准，详细规定了传统培养分离、生化鉴定和血清学鉴定的全套流程。

  • GB/T 5750.12-2023 《生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》：包含了水中志贺菌的浓缩、分离和鉴定方法。

  • 相关产品卫生标准（如GB 14934-2016 食品安全国家标准 消毒餐（饮）具、GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准等）中规定了志贺菌的不得检出要求。

• 国际标准化组织标准（ISO）：

  • ISO 21567:2004 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of Shigella spp.：这是国际通行的食品和动物饲料中志贺菌检测的基准方法，原理与GB 4789.5类似，是各国方法学协调的基础。

• 美国材料与试验协会标准（ASTM）：

  • ASTM F3513-21 Standard Guide for Detection of Shigella Species in Consumer Products：为消费品（如玩具、化妆品、清洁用品）中志贺菌的检测提供了指导性框架，涵盖了采样策略、增菌、鉴定方法的选择和验证。

• 其他区域标准：如美国FDA《细菌学分析手册》（BAM）、欧盟官方检测方法等，均建立了各自的志贺菌检测程序。这些标准在基本原理上趋同，但在培养基选择、培养时间等细节上可能略有差异。

检测仪器

现代志贺菌检测实验室依赖于一系列精密的仪器设备，以提高检测效率和准确性。

1. 全自动微生物接种仪：可自动完成液体样本的稀释、划线接种于平板，实现标准化操作，大幅提高通量和重复性，减少人为误差。

2. 恒温培养箱/全自动培养系统：提供稳定、精确的温度控制（通常为36±1℃），用于样本的增菌培养和平板分离培养。全自动系统可连续监测生长状态。

3. 全自动微生物生化鉴定及药敏分析系统：基于比色或荧光原理，自动判读生化反应板和药敏板的结果，数小时内即可出具鉴定到种和药敏谱报告，是临床和监测实验室的核心设备。

4. 实时荧光定量PCR仪：进行qPCR检测的核心设备，具备多通道荧光检测能力，可用于志贺菌特异基因的快速、定量检测，实现高通量筛查。

5. 脉冲场凝胶电泳系统：由CHEF（钳位均匀电场）驱动器、电泳槽、冷却系统及成像系统构成，用于生成高分辨率的DNA指纹图谱，是分子流行病学调查的关键工具。

6. 全自动酶标仪：用于读取ELISA等免疫学检测结果的吸光度值，实现快速、客观的定量或半定量分析，适用于大批量样本筛查。

7. 基因测序仪：进行MLST或WGS分析的平台，通过测序反应产生海量基因序列数据，为高精度分型和溯源提供基础数据。

8. 生物安全柜：所有涉及活菌操作的环节均需在相应级别的生物安全柜中进行，为操作人员、样品和环境提供关键保护，防止微生物气溶胶扩散。

9. 显微成像系统：集成光学显微镜、数字相机和图像分析软件，用于观察菌落、细胞形态，并可对染色涂片（如革兰氏染色）进行数字化存档和分析。

10. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪：通过获取细菌全细胞蛋白质的指纹图谱，与数据库比对，可在数分钟内完成对纯培养菌落的快速种水平鉴定，正逐渐成为传统生化鉴定的有力补充或替代。

随着技术的进步，志贺菌检测正朝着更快速、更灵敏、更高通量和更智能化的方向发展。传统培养法作为“金标准”仍是确认活性菌的必要手段，而分子生物学和质谱技术等快速方法的融合应用，极大地提升了检测效率和疫情响应能力。