技术概述
内生菌是指在植物生活史中某一阶段或全部阶段生活在植物组织内部，且不引起宿主植物明显病害症状的一类微生物，主要包括内生细菌、内生真菌以及内生放线菌等。内生菌广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实和种子等几乎所有的组织中，与宿主植物形成了复杂的互利共生关系。它们不仅能够促进植物生长、提高植物的抗逆性和抗病性，还能参与植物次生代谢产物的合成，在农业生产、医药开发和生态修复等领域具有重要的应用价值。
传统的内生菌研究主要依赖于纯培养的方法，即通过组织表面消毒后将植物组织研磨、接种于培养基上进行分离培养。然而，研究表明自然界中可培养的微生物仅占总微生物群落的很小一部分，纯培养方法难以全面反映植物内生菌群落的全貌。内生菌高通量测序分析技术的出现彻底改变了这一局面。该技术基于第二代测序平台，通过对环境样本中微生物的特异性基因片段（如16S rRNA基因或ITS序列）进行大规模平行测序，能够快速、全面、精准地揭示内生菌群落的物种组成、多样性水平、群落结构差异以及潜在的功能特征，无需对微生物进行实验室培养，极大地拓展了人类对植物微生物组的认知边界。
内生菌高通量测序分析具有通量高、成本低、周期短、信息量大等显著优势，一次测序即可获得数万条序列信息，覆盖罕见的低丰度微生物类群，是目前植物微生物组学研究中最主流、最有效的技术手段之一。
检测样品
内生菌高通量测序分析适用于各类植物组织样品，常见的检测样品类型包括：
- 根组织样品：包括植物的主根、侧根、须根、根茎等，是研究内生菌的重要材料，通常内生菌丰富度较高；
- 茎组织样品：包括草本植物的茎秆、木本植物的枝条、树皮、木质部等；
- 叶组织样品：包括新鲜叶片、针叶、叶柄等，可用于研究叶内内生菌群落；
- 花和果实样品：包括花瓣、花萼、子房、果皮、果肉等；
- 种子样品：用于研究种传内生菌，探究内生菌的垂直传播规律；
- 其他特殊样品：如药用植物的块根、块茎、鳞茎，藻类、地衣、苔藓等低等植物组织，以及旱生植物、盐生植物等特殊生境植物组织。
样品采集时应注意选择生长健康、具有代表性的植物个体，采集后需迅速用无菌水冲洗去除表面杂质，再进行严格的表面消毒处理以去除附生微生物，随后分装至无菌离心管或自封袋中，标记清楚并于低温条件下保存运输，尽快送至实验室进行检测，以保证内生菌群落结构的真实性和完整性。
检测项目
内生菌高通量测序分析涵盖多种检测项目，可根据研究目的灵活选择：
- 内生细菌多样性分析：基于16S rRNA基因的可变区（如V3-V4区、V4区、V5-V7区等）进行扩增测序，解析内生细菌群落的物种组成与多样性；
- 内生真菌多样性分析：基于ITS序列（如ITS1区、ITS2区）进行扩增测序，揭示内生真菌群落的整体信息；
- 内生菌宏基因组测序：对样品中全部微生物的基因组DNA进行测序，不仅可获得物种组成信息，还能深入挖掘功能基因，研究内生菌群落的代谢潜力；
- α多样性分析：包括Chao1指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数等，反映样品内微生物群落的丰富度和多样性；
- β多样性分析：包括PCA、PCoA、NMDS、群落聚类分析等，反映不同样品间微生物群落结构的差异；
- 物种组成与差异分析：门、纲、目、科、属、种各分类水平的物种注释与丰度统计，LEfSe差异物种分析，以及组间差异显著性检验；
- 功能预测分析：基于测序数据利用相关数据库对内生菌群落的功能进行预测，如代谢通路、酶活性等信息的推断；
- 环境因子关联分析：结合土壤理化性质、气候因子等数据，进行RDA、CCA、相关性分析等，探究环境变量对内生菌群落的影响。
检测方法
内生菌高通量测序分析的标准检测流程如下：
第一步，样品前处理。对采集的植物组织样品进行表面消毒处理，通常依次经过无菌水清洗、75%乙醇浸泡、有效氯或次氯酸钠溶液处理、再次乙醇浸泡和无菌水漂洗等步骤。为验证表面消毒效果，取最后一次漂洗的无菌水涂布于培养基培养，确认无微生物生长，保证后续检测到的微生物均来源于组织内部。
第二步，基因组DNA提取。将表面消毒后的植物组织在液氮中充分研磨，采用专用试剂盒提取组织总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，利用超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度，确保DNA质量满足建库要求。
第三步，PCR扩增与文库构建。以内生菌检测目标对应的特异性引物，对16S rRNA基因或ITS目标区域进行高保真PCR扩增，扩增产物经切胶回收纯化后，利用测序平台配套建库试剂盒进行文库构建，并通过荧光定量对文库进行浓度测定与均一化处理。
第四步，上机测序。将质检合格的文库按相应比例混合后上机，在二代测序平台上进行双端测序，获得原始序列数据。
第五步，生物信息学分析。对原始数据进行质控、去嵌合体等处理，获得高质量序列，随后进行OTU聚类或ASV分析，基于权威数据库进行物种分类注释，开展多样性指数计算、群落结构分析、组间差异比较、功能预测等一系列统计与可视化分析。
第六步，报告出具。整理分析结果，出具包含方法流程、质控信息、分析图表及结果解读的完整检测报告。
检测仪器
内生菌高通量测序分析涉及样品处理、分子实验、测序反应和数据分析等多个环节，需要多种精密仪器设备的支持：
- 二代测序平台：如Illumina MiSeq、NextSeq、NovaSeq等系列高通量测序仪，是获取测序数据的核心设备；
- PCR扩增仪：用于目标基因片段的特异性扩增，配备梯度功能可优化退火温度；
- 凝胶电泳系统：包括琼脂糖凝胶电泳装置和凝胶成像系统，用于DNA质量检测和扩增产物鉴定；
- 超微量分光光度计：用于快速测定DNA的浓度与纯度；
- 荧光定量仪：用于文库浓度的精确定量；
- 生物分析仪：用于文库片段大小分布的精确检测；
- 超净工作台与生物安全柜：为无菌操作提供洁净环境，避免外源微生物污染；
- 高速冷冻离心机：用于DNA提取过程中的各步离心操作；
- 恒温培养箱：用于表面消毒效果验证的培养检查；
- 高通量组织研磨仪：用于植物组织在低温条件下的高效研磨；
- 超低温冰箱：用于样品和DNA的长期保存；
- 高性能计算服务器：承载海量测序数据的生物信息学分析与存储。
应用领域
内生菌高通量测序分析技术已广泛应用于多个科研与产业领域：
- 农业科学研究：解析不同品种、不同栽培条件下作物内生菌群落特征，筛选具有促生作用的内生菌资源，为绿色农业和微生物肥料研发提供理论依据；
- 药用植物研究：研究药用植物内生菌与其活性成分合成之间的关系，发掘可产生活性代谢产物的内生菌菌株，助力天然药物开发；
- 植物病理防控：比较健康与患病植株内生菌群落差异，寻找具有生防潜力的内生菌，开发生物防治制剂；
- 生态环境研究：探究污染土壤、退化生态系统中植物内生菌群落的变化规律，评估内生菌在污染修复与生态恢复中的作用；
- 极端环境生物学：研究荒漠、盐碱地、高寒地区等极端生境植物的内生菌适应机制，揭示微生物与植物的协同进化关系；
- 林业与草业科学：分析林木、牧草内生菌群落结构与功能，服务于优良品种选育与生态系统管理；
- 食品与发酵工业：研究经济作物、茶树、果树等的内生菌多样性，为品质改良和发酵工艺优化提供数据支持。
常见问题
问题一：内生菌高通量测序分析的检测周期是多久？
内生菌高通量测序分析的检测周期一般为7-15个工作日。具体周期会受到多方面因素的影响：首先是检测项目的数量，若同时开展内生细菌与内生真菌的多样性分析或叠加宏基因组测序，周期会相应延长；其次是样品数量，大批量样品的建库与测序排队时间会增加整体周期；第三是方法的复杂程度，单纯的扩增子测序流程相对成熟，而涉及功能预测、多组学关联等深度分析时，生物信息学分析耗时更长；此外，若测序数据质量不合格需要重新实验，也会影响交付时间。部分检测机构提供加急服务，客户如有时间紧迫的特殊需求，可在送检前沟通协商，以便合理安排实验排期。
问题二：内生菌高通量测序分析的检测价格是多少？
内生菌高通量测序分析的检测价格受多种因素综合影响，无法一概而论。主要影响因素包括：检测项目的类型与数量，如仅做内生细菌多样性分析、仅做内生真菌多样性分析，或两者同时开展，甚至叠加宏基因组测序，价格差异较大；测序策略的选择，不同的测序区域、测序深度和数据量要求会直接影响成本；样品数量，大批量样品通常可以享受更优惠的条件；分析内容的深度，标准分析与定制化深度分析的费用不同；检测周期的要求，加急服务可能会产生额外费用。建议有检测需求的客户提前与检测机构的技术人员沟通具体的项目方案，获取针对性的报价信息。
问题三：植物组织样品应如何采集、保存和运输？
样品采集时应选择生长状态一致、具有代表性的健康植株，用灭菌后的剪刀或刀片截取目标组织，尽快用无菌水冲洗表面灰尘。样品分装至无菌离心管或无菌采样袋中，详细标记样品名称、部位、采集时间和地点。样品应置于冰盒中临时保存，长期保存建议放在零下80度或零下20度冰箱中，运输过程中需使用足量干冰或冰袋维持低温，并选择较快的快递方式寄送，避免反复冻融，最大限度保持内生菌群落的原貌。
问题四：如何确保检测到的微生物是真正的内生菌而非表面附生菌？
严格的表面消毒是内生菌研究的关键环节。实验室会按照标准流程对植物组织进行多次消毒处理，包括乙醇浸泡、含氯消毒剂处理和无菌水反复漂洗等步骤。同时设置验证环节：取最后一次漂洗的无菌水涂布平板进行培养，若平板上无菌落生长，则证明表面微生物已被彻底清除，此时从组织内部提取的DNA所反映的即为真正的内生菌信息。此外，实验全程设置阴性对照，进一步排除试剂与环境来源的污染干扰。
问题五：内生细菌和内生真菌测序分别选择什么目标区域？
内生细菌多样性分析通常选择16S rRNA基因的可变区作为目标片段，其中V3-V4区和V4区是应用最广泛的扩增区域，具有数据库信息丰富、注释准确性高的特点。内生真菌多样性分析则一般选择核糖体转录间隔区即ITS序列，其中ITS1区和ITS2区是真菌检测的常用区域，对真菌属、种水平的区分能力较强。客户可根据研究对象的类群特点、预期分辨率和已有文献的通用做法，与技术团队沟通确定最合适的扩增区域。
问题六：一次测序大约能获得多少数据量，重复取样是否必要？
扩增子测序通常每个样品可获得数万条有效序列，能够充分覆盖植物组织内生菌这类中低复杂度群落的多样性。尽管如此，科学研究中依然强烈建议设置生物学重复，一般每组不少于3-5个重复。设置重复的意义在于降低单个样品的偶然性误差，提高组间统计学比较的可靠性和结论的说服力，也是学术成果发表的基本要求。样品数量较多的项目还可以获得更好的批次质控效果。
问题七：检测完成后可以获得哪些结果和数据？
检测完成后，客户可获得完整的分析报告和原始数据。报告内容通常包括：实验流程与方法说明、测序数据质控结果、OTU或ASV统计信息、各分类水平物种组成丰度表、稀释曲线、α多样性指数表、β多样性分析图表、组间差异物种分析、功能预测结果以及相应的结果解读。同时提供原始测序数据文件、分析中间文件和可视化图表源文件，方便客户进行后续深入挖掘与论文撰写。数据交付后如需补充分析，可与技术团队沟通协商。
编辑：北检院编辑部
